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La cantidad de ADN total en una PCR tiene un efecto marcado en el resultado de un procedimiento de PCR. El uso de demasiado ADN total da como resultado ADN empaquetado en el espacio confinado del recipiente de reacción y puede provocar un cebado falso e incluso una síntesis deficiente de ADN debido a la difusión obstruida de grandes moléculas de polimerasa Taq.
- ¿Cuánta plantilla debo agregar a PCR??
- Demasiado cebador puede inhibir la PCR?
- ¿Qué puede hacer que falle una reacción de PCR??
- ¿Cuánto ADN es suficiente para la PCR??
¿Cuánta plantilla debo agregar a PCR??
Aunque en teoría, una molécula de la plantilla sería suficiente, típicamente se usan cantidades considerablemente mayores de ADN para una PCR clásica, por ejemplo, hasta 1 µg de ADN genómico de mamífero y tan solo 1 pg de ADN plasmídico (1).
Demasiado cebador puede inhibir la PCR?
Los contaminantes en la mezcla de dNTP pueden provocar una amplificación incompleta o incorrecta o una inhibición de la PCR. Utilice dNTP de alta calidad. El uso de una concentración excesiva de cebadores puede aumentar la posibilidad de que los cebadores se unan de manera inespecífica a sitios no deseados en la plantilla o entre sí.
¿Qué puede hacer que falle una reacción de PCR??
Olvidar solo un componente de la reacción de PCR, ya sea la ADN polimerasa, los cebadores o incluso la plantilla de ADN, resultará en una reacción fallida. La solución más simple es repetir la reacción. ... Si aún no hay producto de PCR después de esto, es probable que haya algo más que obstaculice su reacción.
¿Cuánto ADN es suficiente para la PCR??
En una reacción típica de 50 µL, 1 o 2 unidades de ADN polimerasa son suficientes para la amplificación del ADN diana. Sin embargo, puede ser necesario ajustar las cantidades de enzima con plantillas difíciles. Por ejemplo, cuando hay inhibidores en la muestra de ADN, aumentar la cantidad de ADN polimerasa puede mejorar los rendimientos de la PCR.
